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口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒說明書

發布時間:2017-4-12 14:45:00??????瀏覽次數:


一 、試劑盒內含物

.說明書亞洲 1 型口疫陽性對照血清己稀釋濃度為 1:8)

.96  ELISA 亞洲 1 型口蹄疫陰對照血清

.液體稀釋槽3% 氧水

.U 96孔抗原抗體反應板25×PBST洗滌液(稀釋時準確量取)

.封板膜豚鼠抗血清稀釋液

.滅活亞洲型口蹄疾病毒抗 (決包裹 )終止液

.亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清包被緩沖液(碳酸鹽)膠囊

.亞洲口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物 (檸檬酸 -磷酸鹽)緩沖片劑

.兔抗豚鼠血清IgG-辣根過氧化物酶結合物OPD片劑

二、器材準備 ( 需用戶自備 )

 1.移液器:5-50μl移液器、0.210μl移液器、50200μl移液器、50300μ12道移液器各一把。

 2.移液槍 (若干)

 3.抗體反應板:微量血凝板(U型、V型均可)5,本試劑盒配備兩塊,用于被檢血清的稀釋和抗抗體反應。注:抗原抗體反應板可重復使用,實驗后,用水沖洗干凈,然后用無離子水沸水浴30,晾干,待用。

 4.純水 , 無離子水或蒸餾水。

試劑準備(需用戶完成)

1.包被緩沖液(PH9.6)

   將本試劑配備的碳酸鹽緩沖液膠囊1粒小心打開,將膠囊內粉末倒入100ml無離子水中溶解即可。4存放,1月內有效。

2. 洗滌液(PBST)

   將本試劑盒配備的 25 倍濃縮 PBST (可能有結晶形成,用時微熱溶化)用無離子水或蒸水做1:25稀釋。(如果PH降低,務必用NaOH調至7.4)

3.底物溶液

  取1檸檬酸鹽片劑(本試劑盒配備)溶于100mL無離子水中,溶化后,50mL溶液再加1片鄰苯二(OPD)片劑,充分溶解,分裝5mL/ 瓶或 10Ml ), 避光之-2O℃保存。用前光溶化 ,時每1mL上述溶液加 10μL本試劑配備的 3% 雙氧(H202務必加雙氧水!

操作步驟

 1.用包被緩沖液稀釋亞洲 1 口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度(1:1000),  ELISA 板上每孔加 50μl振蕩 , 封板或室溫過夜。

2. 抗體(陰陽性對照血清及待檢血清)反應

根據不同的需要,選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應板上操作

196 孔酶標板檢測 10 份樣品布局圖


S1 1:8

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

+1:32

-1:4

1:16

164

1:8

1:32

1128

1:64

1256

1:128

1512

1:256

1:1024

1:512

1:2048

1:l024

1:4096


為抗體滴度測定 (定量檢測 10 份樣品布局圖; 2 為抗體滴度測定定量 )檢測 20 份樣品布局圖。

296 孔酶標板檢測 20 份樣品布局圖


S11:32

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

+1:32

-1:4

1:64

1:64

1:8

1:128

1:128

1:256

1:256

S111:32

S12

S13

S14

S15

S16

S17

S18

S19

S20

1:512

1:64

1:1024

1:128

1:2048

1:256

1:4096


以圖為例 ,  U 型血凝板上按 50 μl/孔量用 PBST 將待檢 血清從1:4開始做2倍連續稀釋至 1:512。同時,按圖示稀釋陰陽對照血清 , 然后每加入 50 μl PBST 稀釋到使用濃度的亞洲型口疫病毒抗原 (1:4,1份病毒抗、加3PBST), 病毒抗對照孔加100μl。振蕩混勻,封板,4℃過夜。加入病毒抗原后血清的稀釋度變為從1:8開始的2倍稀釋。

3.用洗滌液 (1×PBST)  ELISA,在洗水紙上甩干,再將抗抗體混合物從抗抗體反應板上按次序轉移至ELISA板上的相對應孔,每孔50μl封板,37溫育1小時。

4.同上洗5甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度 (1:1000), 孔加50μl,封板,37溫育1小時。

5.同上洗 5  , 甩干。用 l×PBST 稀釋兔抗豚鼠酶結合物至工作濃度 (1:500), 孔加 50 μl封板 ,37 溫育 1 小時。

6. 同上洗板5,孔加50μl底物溶液 (務必加雙氧水),37溫育15分鐘。每孔再加50μl終止液終止反應,立即在492nm波長下讀取光吸收值(OD492nm)

五、結果判定

1. 試驗認可標準

每塊板設 4 孔病毒抗原對照,病毒抗原對照不加任何血清,直接用PBST稀釋至使用濃度,與血清/病毒抗原復合物同步加入ELISA板孔,50μl/,病毒抗原對照OD492nm 值應在1.5±0.5范圍內。 陽性對照抗體效價應在1:1024±1滴度以內,陰性對照血清抗體效價應<1:8

2.病毒抗原對照平均OD492nm 50%計算(臨界值)

抗原對照是4,棄去最高和最低OD492nm,計算剩余2孔的平均OD492nm,再除以2,50%對照值。該值即為臨界值,表示阻斷50%反應的對照OD492nm值。

3.結果判定

以病毒抗原對照平均OD492nm 值的50%為臨界值,被檢血清稀釋孔OD492nm值大于臨界值的孔為陰性孔,小于或等于臨界值的孔為陽性孔,陽性孔的OD492nm值等于臨界值時所對應的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均OD492nm值為1.2,則其50%0.60。若某一待檢血清在1:128OD492nm值為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為 1:128 。若臨界值處于兩個滴度之間 ,如處于1641128之間,則抗體滴度取中間值為1:9O。定性檢測中 , 兩個重復孔只要有 一孔為陽性孔 , 則抗體滴度判 定為 1:128, 兩孔均為陽性孔 , 則判定 為抗體滴度>1:128 

ELISA抗體效價≥1:128,判定為亞洲 1 型口蹄疫抗體陽性。

ELISA抗體效價與保護力的關系:牛、羊:抗體效價≥1:128,99% 保護;效價≤1:16, 不保護;效價在1:22-90之間,50%保護。


豬瘟正向間接血凝試驗試劑使用說明書

一、原理

用己知血凝抗原檢測未知血清抗體的試驗,稱為正向間接血凝試驗,亦稱間接血凝。抗原與其對應的抗體相遇,在一定條件下形成抗原——抗體復合物。但這種復合物的分子團很小人肉眼看不見。將抗原吸附(致敏)在紅細胞表面,制成豬瘟血凝抗原,用于檢測免疫動物血清中的豬瘟抗體水平。

這種經過豬瘟抗原致敏的紅細胞與豬瘟抗體相遇,紅細胞便出現清晰的凝集現象。

二、適用范圍

主要用于檢測豬瘟免疫抗體效價,以便制定正確的免疫程序,保障豬群免遭豬瘟強毒的感染。

三、試驗器材,

196110V型醫用血凝板,與血凝板大小相同的玻板。

21微量移液器(50微升、25微升)取液塑料咀。

3、微量振蕩器。

4豬瘟血凝抗原

5豬瘟陰性對照、血清。

6豬瘟陽性對照血清。

7、稀釋液。

8、待檢血清(每頭約0.5ml血清即可)。

四、試驗方法

1、加稀釋液

在血凝板上16排的19孔;第7排的14孔第6孔;第8排的112孔各加稀釋液50微升。

2、稀釋待檢血清

1號待檢血清50微升加入第1排第l孔,并將塑咀插入孔底,右手拇指指輕壓彈簧12次混勻(避免產生過多的氣泡),從該孔取出50微升移入第2孔,混勻后取出50微升移入第3孔……直至第9孔混勻后取出50微升丟棄。此時第114孔待檢血清的稀釋度(稀釋倍數)依次為:1:21)、1:4(2)1:8(3)1:16(4)1:32(5)1:646)1:128(7)1:256(8)1:512(9)

2號待檢血清加入第2:3號待檢血清加入第3排……均按上法稀釋,注意!每取1份血清時,必須更換塑咀一個。

3、稀釋陰性對照血清

在血疑板上的第7排第1孔加陰性血清50微升,對倍稀釋至第4孔,混勻后從該孔取出50微升丟棄。此時陰性血清的稀釋倍數依次為1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:16(4)。第6孔為稀釋液對照。

4、稀釋陽性對照、血清

在血凝板上的第8排第1孔加陽性血清50微升,對倍稀釋至第12孔,混勻后從該孔取出50微升丟棄。此時陽性血清稀釋倍數依次為1:21:4096

5、加血凝抗原

被檢血清各孔、陰性對照血清各孔、陽性對照血請各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原(充分搖勻,瓶底應無血球沉淀)25微升。

6、振蕩混勻

將血凝板置于微量振蕩器上振蕩12分鐘,如無振蕩器;用手輕輕搖勻亦可。然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻,不出現血球沉淀為合格。蓋上玻板,室溫下或37下靜置1.52小時判定結果,也可延至翌日判定。

7、判定標準

移去玻板,將血凝板放在白紙上,先觀察陰性對照血清1:16孔,稀釋液對照孔,均應無凝集(血球全部沉入孔底形成邊緣整齊的小圓點),或僅出現凝集(血球大部沉于孔底,邊緣稍有少量血球懸浮)

陽性血清對照、1:21:256各孔應出現“++++++”凝集為合格,(少量血球沉入孔底,大部血球懸浮于孔內)

在對照孔合格的前提下,再觀察待檢血清各孔,以呈現“++”凝集的最大稀釋倍數為該份血清的抗體效價。例如1號待檢血清15孔呈現“++++++”凝集,67孔呈現“++”凝集,第8孔呈現“+”凝集,第9孔無凝集,那么就可判定該份血清的豬瘟抗體效價為1:128

接種豬瘟疫苗的豬群免疫抗體效價達到1:16(即第4)呈現“++”凝集為免疫合格。

五、檢測試劑性能要求

1、性狀

(l)液體血凝抗原:搖勻呈棕紅色(或咖啡色),靜置后,血球逐漸沉入瓶底。

(2)陰性對照血清:淡黃色清亮稍帶粘性的液體。

(3)陽性對照血清:微紅或淡黃色稍混濁帶粘性的液體。

(4)稀釋液:淡黃或無色透明液體,低溫下放置,瓶底易析出少量結晶,在水浴中加溫后即可全溶,不影響使用。

2、包裝

()液體血凝抗原:搖勻后即可使用,5ml/瓶,每瓶檢測3040頭份血清。

(2)陰性血清:2ml/瓶,直接稀釋使用。

(3)稀釋液:100ml/瓶,直接使用4保存。

3、保存條件及保存期

(l)液體血凝抗原:4保存(切勿凍結),保存期4個月。

(2)陰性對照血清:-15-20保存,有效期2年,4保存有效期半年。

(3)陽性對照血清:-15-20保存,有效期2年,4保存有效期半年。

六、注意事項

1、為使您的檢測獲得正確結果請您在檢測前仔細閱讀本說明書。

2、嚴重溶血或嚴重污染的血清樣品不宜檢測以免發生非特異性反應。

3、勿用90130血凝板以免誤判結果。

4、本法可單獨檢測豬瘟抗體水平也可同步檢測口蹄疫免疫抗體水平。

5、用過的血凝板應及時在水龍頭下沖凈血球。再用蒸餾水或去離子水沖洗2甩干水份放37恒溫箱內干燥備用。檢測用具應煮沸消毒37干燥備用。

6、每次檢測只做一份陰性、陽性和稀釋液對照。、

-”表示完全不凝集或010%血球凝集;

+”表示10-25%血球凝集;+++”表示75%血球凝集;

"++"表示50%血球凝集;++++”表示90100%血球凝集


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